【SCI 22分客户成果】circRNA抑制由DNA感受器cGAS介导的长期造血干细胞耗竭

      中科院生物物理研究所的范祖森教授课题组主要从事肿瘤干细胞、免疫细胞发育分化及肿瘤靶标发现与肿瘤个体化治疗等领域的研究,近期其团队利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓细胞(BM)中分离的长期造血干细胞(LT-HSCs)和多能干细胞(MPPs)的circRNAs表达谱。研究筛选出一个在LT-HSCs细胞核高表达的circRNA cia-cGAS,通过一系列功能机制实验发现LT-HSCs中cia-cGAS可以与DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互结合并抑制了其酶活性,阻碍cGAS结合基因组DNA,从而不能激活I型干扰素(IFN)的表达,维持LT-HSCs的静息状态。该研究同时也发现cia-cGAS是cGAS介导的自身免疫相关的有效抑制剂,为有效防治自身免疫性疾病与血液系统恶性肿瘤提供了新思路和潜在药物研发靶标。研究成果2018年发表在国际知名学术期刊Immunity(IF=22.845)。(芯片实验由康成生物提供技术服务

研究背景

       长期造血干细胞作为潜能最高的干细胞系,具有最高的更新和分化能力,可以为短期造血干细胞、多能干细胞等提供了持续性细胞补给。大多数时候,LT-HSCs处于休眠的静息状态,其干性的维持受转录因子及骨髓内环境等多种因素的影响,比如TNF、CXCL4和I型IFN等,然而LT-HSCs在静息状态与激活状态之间的精细调控机制尚未完全解析。

       cGAS作为胞质DNA感受器已被广泛研究。在结合DNA时,cGAS会催化cGAMP的生成,cGAMP能结合干扰素刺激因子并诱导cGAS-STING信号通路的激活,从而上调I型IFN的表达和一系列免疫反应。cGAS不仅可以识别病原性DNA,还可识别机体自身DNA。在造血干细胞中,细胞核内的cGAS是如何避免与自身DNA结合并防止自身免疫反应和机体损伤,仍少见研究报道。

       CircRNAs是一大类具有闭合环状结构的非编码RNA分子,通过多种机制发挥调控作用,然而关于circRNAs在LT-HSCs静息状态调控方面研究仍然比较少。本研究的目的就是通过circRNA芯片筛选验证调控LT-HSCc静息状态的circRNAs,并通过一系列功能机制实验研究该调控的作用机制,为有效防治自身免疫性疾病与血液系统恶性肿瘤提供新思路和潜在药物研发靶标。

研究思路

       首先作者通过Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分离的LT-HSC与MPPs的circRNAs表达谱,筛选出156种差异表达的circRNAs, qPCR验证结果与芯片一致。shRNA慢病毒转染发现,只有D430042O09Rik基因转录的circRNA cia-cGAS可以影响LT-HSCc的亚群分布。随后作者通过qPCR、Northern blot、核质分离及原位杂交实验发现cia-cGAS在LT-HSCs的细胞核内高度表达。

       接下来作者对cia-cGAS的相关功能进行了研究。作者通过删除下游的反向互补序列特异性敲除cia-cGAS,FACS分析表明敲除后LSK细胞明显增多,LT-HSC明显减少,并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色阳性率明显高于对照组,表明敲除后LT-HSCs处于活跃的增殖阶段。脉冲标记也显示敲除后LT-HSCs细胞静息状态的比例显著降低。然后作者通过对敲除小鼠的mRNA表达谱分析发现I型IFN表达显著上调,qPCR和ELISA也验证了这一结果。以上实验表明cia-cGAS可以通过I型IFN信号传导调控LT-HSCs的静息状态。

       最后作者对cia-cGAS发挥功能的分子机制进行了探讨。RNA pull down、RIP、免疫荧光、EMSA和FISH实验发现cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下来作者通过酶活测定、ChIP、HPLC、荧光素酶和质谱实验表明cia-cGAS可以阻碍cGAS与LT-HSCs自身DNA结合,从而抑制其酶活性,不能激活I型IFN的表达。然后作者用CRISPR/Cas9突变cGAS基因,qPCR、ELISA、BrdU标记等实验表明,突变后I型IFN表达被抑制,LT-HSCs细胞数量正常且更多的维持在静息状态。这些均表明了cia-cGAS作用的机制就是通过结合cGAS抑制其表达,从而不能激活I型IFN的表达,维持LT-HSC的静息状态。动物实验显示,在cia-cGAS敲除的小鼠中,poly(I:C)与HSV病毒的刺激均可导致大量I型干扰素的产生,从而诱发自身免疫性疾病,而cia-cGAS过表达则可以消除这些,表明cia-cGAS是cGAS介导的自身免疫疾病的有效抑制剂。

技术路线

结果展示

图1 Arraystar mouse circRNA芯片筛选和qPCR验证结果及cia-cGAS表达分析结果,cia-cGAS在LT-HSCs细胞核中高表达

图2 cia-cGAS功能研究结果,cia-cGAS可以通过I型IFN信号传导调控LT-HSCs静息状态

图3 cia-cGAS机制研究结果,cia-cGAS结合cGAS抑制其表达,从而不能激活I型IFN的表达,维持LT-HSCs的静息状态,cia-cGAS是cGAS介导的自身免疫疾病的有效抑制剂

研究意义

       本研究通过Arraystar Mouse CircRNA Array筛选出一个LT-HSCs细胞核高表达的circRNA cia-cGAS,功能机制实验发现LT-HSCs中cia-cGAS可以与DNA敏感的cGAMP合酶cGAS结合抑制其酶活性,阻碍cGAS结合基因组DNA,从而不能激活I型IFN的表达,维持LT-HSCs的静息状态。同时cia-cGAS是cGAS介导的自身免疫相关的有效抑制剂,为有效防治自身免疫性疾病与血液系统恶性肿瘤提供了新思路和潜在药物研发靶标。

原文出处
A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity,2018.
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